S期又称为DNA合成期，是指从DNA合成开始到DNA合成结束的整个时期。DNA合成期是DNA在细胞周期中功能最活跃的时期。在这段时间内，DNA既要完成自己的复制，又要进行转录和合成蛋白质的活动。DNA复制需SPF的启动信号，必须处于感受状态（competent）的染色质DNA才能开始复制。

用细胞融合的方法，将Gi期的细胞与S期细胞融合形成杂种细胞，可见G₁期细胞提前进入S期，说明S期细胞质中含有促进G₁期细胞进入DNA合成的启动因子。DNA复制有一定的顺序。一般常染色质和富含CG的碱基片段先复制，异染色质和富含A-T的碱基片段后复制。蛋白质合成比较活跃。在G1期晚期开始合成的DNA复制所需的酶和蛋白，进入S期后活性提高并参与DNA的合成。大量新合成的蛋白质迅速通过核孔进入细胞核，DNA聚合酶等参与DNA的合成，组蛋白、非组蛋白与新合成的DNA组装成新的核小体。