磷酸二酯键是两个核苷酸分子核苷酸残基的两个羟基分别与同一磷酸基团形成的共价连接键。例如前一个核苷酸的羰基中的3'碳上—OH（羟基）和后一个核苷酸的5'—磷酸基形成酯键，此处的磷酸基同时与前后两个羟基形成酯键，故称磷酸二酯键。依次连下去，形成多核苷酸链，即核酸大分子链。

phosphodiester linkage

磷酸二酯键

如图1所示，磷酸和两个五碳糖的羟基（3'—OH， 5′—OH）发生酯化反应形成的化学基团为磷酸二酯键。代表性的磷酸二酯键是核苷酸与核苷酸之间的键。需要注意的是磷酸二酯键是一种化学基团，而不是通常化学意义上所说的共价键或离子键。此键可以看做是一分子磷酸和两个五碳糖分子等的羟基（3'—OH， 5′—OH）发生酯化反应形成的，即磷酸脱去两个羟基，两个五碳糖的3'-OH和5'-OH各脱去一个氢，从而形成了3'，5'—磷酸二酯键。此键可由酸、碱或酶的作用而水解。DNA聚合酶，限制性核酸内切酶（限制酶），DNA连接酶，DNA水解酶，RNA聚合酶等都可作用于磷酸二酯键。DNA中的磷酸二酯键极其稳定。在25℃，pH7.0的中性水溶液的条件下，其半衰期长达千亿年，比地球自身的年龄还大。欲使DNA中的磷酸二酯键在数分钟之内发生水解，要求催化剂能够高达10¹⁷数量级的速率增强因子。磷酸二酯键的高度稳定性被认为是核酸作为遗传物质的重要原因之一。